OPTIMASI ANNEALING TEMPERATURE PRIMER MRNA RECK DENGAN METODE ONE STEP QRT-PCR

Abstract

Identifikasi mRNA untuk mengukur ekspresi suatu gen dapat dijadikan sebagai alat diagnostik suatu penyakit. mRNA RECK menghasilkan protein RECK yang terbenam dalam membran glikoprotein sel sehingga memperkuat integritas sel. Ekspresi mRNA RECK dikaitkan dengan proses fisiopatologis dalam kanker ovarium.

Metode one step qRT –PCR sangat sensitif dan akurat, namun membutuhkan kompleksitas yang tinggi. Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi hasil kuantifikasi mRNA adalah suhu annealing primer mRNA RECK.

Penelitian ini melakukan optimasi suhu annealing secara in-silico melalui http://tmcalculator.neb.com/ dan http://www.biophp.org/minitools/melting_temperature diperoleh suhu 49°C (57°C primer forward; 54°C primer reverse) dan 51,8°C primer forward; 51,1°C primer reverse. Proses selanjutnya yaitu melakukan running qRT-PCR menggunakan suhu bertingkat. Suhu 55,6°C pada awal optimasi menunjukkan hasil yang baik terlihat dari kurva meltpeak yang spesifik pada suhu 75°C. Namun setelah proses running menggunakan sampel yang berbeda, hasil meltpeak tidak spesifik. Proses optimasi kedua diperoleh suhu 52,5°C dengan meltpeak spesifik suhu 76,5°C. Optimasi annealing dilanjutkan dengan melakukan persamaan konsentrasi RNA template menggunakan pengenceran perbandingan 1:3 (RNA: Nuclease Free Water (NFW))

Kesimpulan dari penelitian ini diperoleh suhu annealing mRNA RECK sebesar 52,5°C dan pengenceran 1:3 RNA dengan NFW, serta penggunaan reagen KAPA one step PCR tanpa penambahan dUTP dan ROX high serta ROX low.